Phương pháp phân tích tế bào máu ngoại vi trên công nghệ laser hoàn toàn

 
RBC trước tiên được xử lý cầu hóa đẳng thể tích (isovolumetrically sphered) bằng SDS và cố định bằng Glutaraldehyde nhằm loại trừ sai sót có thể có do những tư thế khác nhau của hồng cầu khi đi ngang điểm đo. Sau khi xử lý, hồng cầu (và cả tiểu cầu) được đổi thành một hình cầu có cùng thể tích như ban đầu, nhưng có thể đo trong mọi tư thế mà vẫn phản ảnh đúng thể tích hồng cầu (red cell volume).
Khi đi ngang điểm đo (flowcell), xử dụng nguồn sáng là laser diod 670nm, và phân tích tán xạ (scattered light) ở hai góc : góc hẹp (2-3o) phản ảnh kích thước vật thể - tức là thể tích hồng cầu (CV : Cell Volume), và góc rộng (5-15o) phản ảnh hàm lượng hemoglobin trong hồng cầu (CH : Cell Hemoglobin). Tín hiệu thu được trên mỗi góc là một cặp dữ liệu liên quan đến mỗi hồng cầu đi ngang qua điểm đo (nguyên tắc khảo sát từng tế bào – cell-by-cell) và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie.
 
Thông qua dữ liệu ghi nhận được, sẽ đưa ra được các thông số về hồng cầu như sau :
-    RBC (số lượng hồng cầu) : dựa trên tổng số tín hiệu đếm được trong ngưỡng quy định.
-    CV và CH
-    HC (nồng độ hemoglobin hồng cầu, tính bằng g/dL) = CH / CV
-    HCT (khối thể tích hồng cầu) : là kết quả dựa trên tổng các CV.
-    MCV (thể tích trung bình hồng cầu) : trung bình cộng của các CV.
-    MCH (hàm lượng hemoglobin trung bình hồng cầu) : là kết quả dựa trên tổng các CH.
-    CHCM (tương đương MCHC) : trung bình cộng của các CH.
-    RDW (độ phân bố thể tích hồng cầu)
-    HDW (độ phân bố nồng độ hemoglobin)
-    CHDW (độ phân bố hàm lượng hemoglobin)
Đặc biệt lưu ý là 3 thông số MCV, MCH và CHCM là các thông số đo trực tiếp, chứ không tính toán dựa trên hemoglobin như đa số các hệ thống huyết học dùng nguyên tắc kháng trở điện.
Ngoài biểu đồ RBC chính trình bày sự phân bố và tương quan các yếu tố CH và CV, còn có các biểu đồ trình bày sự phân bố của CV, CH và HC. Trên biểu đồ chính sẽ thể hiện sự xếp loại các tế bào theo tiêu chuẩn :
-    Micro (hồng cầu nhỏ): khi CV < 60 fL
-    Macro (hồng cầu to): khi CV > 120 fL
-    Hypo (hồng cầu nhược sắc): Khi CH < 28 G/dL
-    Hyper (hồng cầu ưu sắc): Khi CH > 41 G/dL

Đồng thời có thể xem được các thông số phụ là % số tế bào được xếp loại là micro, macro, hypo và hyper.
Dựa trên các thông số % phụ này mà các cảnh báo về hình thái tế bào (morphology flag) sẽ được đưa ra khi thỏa các điều kiện quy định trước cho các loại cảnh báo này : ANISO (hồng cầu to nhỏ không đều), MACRO, MICRO, HCVAR (nồng độ hemoglobin hồng cầu không đều), HYPO, HYPER.
Ngoài ra còn các cảnh báo hình thái khác liên quan đến hình dạng bất thường của hồng cầu hoặc các loại nhiễu có thể có : RBC fragments (mảnh vỡ hồng cầu), RBC Ghosts (bóng ma hồng cầu), NRBC (hồng cầu nhân). Ghi chú : các ngưỡng quy định cho cảnh báo hình thái đều có thể thay đổi được do người xử dụng.

2. Nguyên tắc phân tích Hemoglobin
Phương pháp phân tích thông thường là đo quang ở bước sóng 546 nm sau khi ly giải hồng cầu bằng thuốc thử cyanmethemoglobin (hoặc thuốc thử tương đương thay thế không chứa cyanide).
Điểm đặc biệt là các thông số MCH và MCHC (tính toán từ Hemoglobin đo được) được kiểm tra chéo với các thông số CH và CHCM (đo trực tiếp trên tế bào không ly giải). Hệ thống ADVIA 120 sẽ lưu ý người xử dụng khi hai số đo có sự chênh lệch quá một giới hạn nhất định và thường do một trong các nguyên nhân :
-    Mẫu thử có nhiều mỡ (lipidemic), bilirubin hay chilomicron, mẫu thử có số lượng bạch cầu quá cao (> 60 x 103/L), tiểu cầu bị kết cụm, mẫu thử trẻ sơ sinh… làm sai lệch kết quả đo quang.
-    Sự cố kỹ thuật trên một trong 2 kênh hemoglobin hoặc RBC.
Lưu ý trên đây sẽ giúp người xử dụng  có những biện pháp thích hợp nhằm tìm ra nguyên nhân.

3. Nguyên tắc phân tích Hồng Cầu Lưới (Reticulocyte)
Phương thức xử lý và phân tích tương tự như khi khảo sát hồng cầu thông thường, nhưng hồng cầu lưới được nhuộm với chất nhuộm màu nucleic acid (Oxazine 750) và khảo sát độ hấp thu chất màu này cùng trên nguồn sáng là laser diod 670nm, đối chiếu trực tiếp với kích thước và hàm lượng hemoglobin của hồng cầu lưới. 
Kết quả khảo sát được cho phép đưa ra được các thông số về hồng cầu lưới như sau :
-    Retic (Reticulocyte - hồng cầu lưới) : số lượng tuyệt đối và phần trăm % so với tổng số hồng cầu.
-    CHr (hàm lượng hemoglobin hồng cầu lưới).
-    MCVr (thể tích trung bình hồng cầu lưới).
-    CHCMr (nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu lưới).
 

Biểu đồ Retic chính trình bày sự phân bố và tương quan của hồng cầu lưới so với hồng cầu bình thường (HC lưới có màu xanh sáng so với HC bình thường màu đỏ); biểu đồ hấp thu Oxazine 750 cho phép đánh giá chất lượng của hồng cầu lưới ở các mức L, M và H (đánh giá độ trưởng thành của HC lưới tuỳ sự hiện diện của nhân hoặc lưới RNA còn lại trong hồng cầu) cũng như các thông số phụ về % các nhóm L, M và H này. Các biểu đồ phụ trình bày sự phân bố các yếu tố CHr, CHCMr và CVr, có đối chiếu với sự phân bố của hồng cầu bình thường trên cùng thang đo cho dễ nhận định (HC lưới có màu xanh so với HC bình thường màu đỏ).
4. Nguyên tắc phân tích Bạch Cầu – Kênh Basophil-Lobularity 
 

Phương thức xử lý : Dựa trên nguyên tắc được phát hiện là basophil có xu hướng đề kháng sự ly giải bởi một hổn hợp acid và chất surfactant (1) ; máu toàn phần được trộn với thuốc thử (phtaleic acid & Ssurfactant). Hồng cầu bị ly giải và tế bào chất của tất cả các loại bạch cầu khác – ngoại trừ basophil – bị loại khỏi tế bào. Hổn hợp mẫu thử được phân tích trên cùng hệ thống quang học như phân tích hồng cầu : nguồn sáng là laser diod 670nm, phân tích tán xạ góc hẹp 2-3o phản ảnh kích thước bạch cầu và góc rộng 5-15o phản ảnh độ phức tạp của nhân bạch cầu (số múi nhân). 
Kết quả được trình bày trên biểu đồ Baso, đối chiếu kích thước bạch cầu và độ phức tạp của nhân, xử dụng ranh giới động (tìm điểm lỏm xuống thấp nhất phân chia hai quần thể tế bào khác nhau) để ghi nhận số lượng basophil, số tế bào đơn nhân và đa nhân.
 

5. Nguyên tắc phân tích Bạch Cầu – Kênh Peroxidase 
Để bách phần đầy đủ các thành phần bạch cầu, thì thông tin của riêng kênh Basophil-Lobularity rõ ràng là chưa đủ, do đó cần phối hợp thêm một kênh phân tích khác là kênh Peroxidase.
Men peroxidase hiện diện và hoạt động ở nhiều loại bạch cầu khác nhau. Dưới sự hiện diện của hydrogen peroxide và một chất màu nhận electron (khử) thích hợp, peroxidase tạo ra một chất màu đậm bên trong bạch cầu. Sự cải tiến kỹ thuật cố định tế bào cho phép phân lập rõ Monocyte khỏi nhóm Neutrophil cũng như nhóm LUC (Large Unstained Cell : các tế bào to không bắt màu), do đó kênh Peroxidase cho phép đếm chính xác 3 nhóm bạch cầu bắt màu (Neutrophil, Eosinophil và Monocyte) và 2 nhóm không bắt màu (Lymphocyte và LUC) :
-    Neutrophil và Eosinophil được nhận biết do có hoạt tính peroxidase rất cao, nhưng có thể phân biệt hai loại tế bào này nhờ sự khác biệt về kích thước. 
-    Monocyte chứa một hàm lượng thấp peroxidase, nên có thể phân biệt được thành một quần thể riêng biệt, tách khỏi nhóm LUC, nhưng có thể chồng lấp một phần với một số tế bào Neutrophil chứa quá ít peroxidase.
-    Quần thể Lymphocyte chứa cả Lymphocyte lẫn Basophil, do đó cần phải trừ ra từ số lượng Basophil đếm được trên kênh Basophil-Lobularity.
 
Kỹ thuật : máu toàn phần được lần lượt trộn với 3 thuốc thử. Ở bước 1 (Perox 1), hồng cầu bị ly giải và các tế bào bạch cầu được cố định. Ở bước 2 (Perox 2 và Perox 3), Neutrophil, Eosinophil và Monocyte được nhuộm màu peroxidase trong khi Lymphocyte, Basophil và LUC không bắt màu. Hổn hợp mẫu thử được phân tích trên hệ thống quang học với nguồn sáng tungsten, phân tích tán xạ góc hẹp 2-3o phản ảnh kích thước bạch cầu và độ hấp thu quang phản ảnh độ bắt màu (hoạt tính) men peroxidase của bạch cầu. Kết quả được trình bày trên biểu đồ Perox, đối chiếu kích thước bạch cầu và hoạt tính men peroxidase của bạch cầu, xử dụng ranh giới động (tìm điểm lỏm xuống thấp nhất phân chia hai quần thể tế bào khác nhau) để ghi nhận số lượng từng quần thể bạch cầu : Neutrophil, Eosinophil, Monocyte, LUC, và tổng của Lymphocyte + Basophil. 
Dữ liệu thu được từ cả 2 kênh Basophil-Lobularity và Peroxidase cho phép đưa ra được các thông số về bạch cầu như sau :
-    Số lượng bạch cầu : dựa trên số lượng đếm được trên kênh Peroxidase (gọi là thông số WBCP), có so sánh với số lượng đếm được trên kênh Basophil-Lobularity (gọi là thông số WBCB).
-    Số lượng tuyệt đối và phần trăm % các thành phần bạch cầu : Neutrophil, Eosinophil, Basophil, Lymphocyte, Monocyte, và LUC.
-    Chỉ số múi nhân (LI – Lobularity Index) và chỉ số hoạt tính peroxidase (MPXI – Mean Peroxidase Index)
 

Ngoài ra còn các cảnh báo hình thái khác liên quan đến sự phân bố bất thường của bạch cầu : LEFT Shift (công thức bạch cầu chuyển trái, do gia tăng số múi nhân của bạch cầu hạt), IG-Immature Granulocyte (bạch cầu hạt chưa trưởng thành, tức là dạng Band), ATYP-Atypical Lymphocyte (lymphocyte không điển hình, đặc trưng thường thấy khi nhiễm siêu vi), BLAST (nghi ngờ có các tế bào đầu dòng bất thường). 
Điểm đặc biệt là hai thông số WBCB và WBCP được kiểm tra chéo với nhau. Hệ thống ADVIA 120 sẽ lưu ý người xử dụng khi hai số đo có sự chênh lệch quá một giới hạn nhất định và thường do một trong các nguyên nhân :
-    Bệnh lý khiếm khuyết men Myelo-peroxidase di truyền hay mắc phải, có thể gặp ở tần suất cho đến 0.5%. Trong trường hợp này sẽ có xu hướng giảm WBCP.
-    BUN (Urea Nitrogen) máu rất cao (> 200-250 mg/dL) làm ly giải không hoàn toàn hồng cầu, nên có xu hướng làm tăng WBCP.
6. Nguyên tắc phân tích Tiểu Cầu 
Phương thức xử lý ban đầu và phân tích tiểu cầu cũng tương tự như khi khảo sát hồng cầu (xử dụng nguồn sáng là laser diode 670nm, và phân tích tán xạ), nhưng tiểu cầu được khảo sát 2 chiều ở ngưỡng thấp, phân tích góc hẹp (2-3o) phản ảnh kích thước tiểu cầu (volume), còn phân tích góc rộng (5-15o) phản ảnh mật độ tế bào (Cell density). Tín hiệu thu được trên mỗi góc là một cặp dữ liệu liên quan đến mỗi tiểu cầu đi ngang qua điểm đo (nguyên tắc khảo sát từng tế bào – cell-by-cell) và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie như khảo sát hồng cầu.

Điểm đặc biệt là phương pháp này không loại trừ các tiểu cầu to (large platelets), nhưng để phân tích và đếm số lượng tiểu cầu to sẽ có nguy cơ nhầm lẫn với các thành phần khác như : mảnh hồng cầu, bóng ma hồng cầu… ; cũng như kích thước của tiểu cầu to thường chồng lấn với hồng cầu, đặc biệt là hồng cầu nhỏ. Do đó cần thêm yếu tố mật độ tế bào, và tiêu chí để phân biệt tiểu cầu thực sự so với các thành phần khác được căn cứ theo bảng dưới đây :
 

Do đó, kết quả báo cáo số lượng tiểu cầu sẽ được tính chung với số tiểu cầu to đếm được, nhưng đã loại trừ các thành phần không phải là tiểu cầu. Ngoài ra khi số lượng tiểu cầu to vượt quá một giới hạn nhất định, sẽ có lưu ý hình thái Large Platelets hay Platelet Clump tương ứng. Tất nhiên là khi có mảnh hồng cầu, bóng ma hồng cầu… với số lượng đáng kể thì cũng sẽ có lưu ý hình thái tương ứng (RBC Fragments, RBC Ghosts).

(Nguồn: Bệnh viện)